細胞轉染
細胞轉染（Transfection）是指將DNA或者RNA導入真核細胞中的過程。轉染的目的是產(chǎn)生重組蛋白，或特異性增強或抑制轉染細胞中的基因表達。
根據(jù)導入的核酸存在于宿主細胞的時間長短，可以分為瞬轉和穩(wěn)轉。
| 瞬轉 |
穩(wěn)轉 |
|
導入的DNA沒有整合到基因組中，而是保留在細胞核上 |
導入的DNA整合到基因組中 |
|
導入的遺傳物質不傳遞到子代； 遺傳改變只是暫時的 |
導入的遺傳物質能夠代代相傳；遺傳改變是永久的 |
|
不需要選擇性篩選 |
需要選擇性篩選出穩(wěn)定轉染的細胞 |
|
DNA載體和RNA都可用于瞬時轉染 |
只有DNA載體可用于穩(wěn)定轉染；RNA本身不能穩(wěn)定地導入細胞中 |
|
導入的遺傳物質的高拷貝數(shù)導致高水平的蛋白質表達。 |
單拷貝數(shù)或低拷貝數(shù)的穩(wěn)定整合的DNA導致較低水平的蛋白質表達。 |
|
通常在轉染后24-96小時內(nèi)收獲細胞。 |
需要2-3周的時間篩選出穩(wěn)定轉染的細胞克隆。 |
|
通常不適合使用具有誘導型啟動子的載體的研究。 |
適用于使用帶有誘導型啟動子的載體的研究。 |
1、材料
293T細胞、MyoD表達質粒和EGFP表達質粒、DMEM培養(yǎng)基、鏈霉素/青霉素(雙抗)、FCS(小牛血清)、PBS(磷酸鹽緩沖溶液)、胰酶/EDTA消化液、轉染試劑(TransFast)
2、器材
20ul/200ul/1ml微量移液器和Tip頭酒精燈、廢液缸、血球計數(shù)板、渦旋振蕩器、恒溫水浴箱、臺式離心機、35mm培養(yǎng)皿、轉染管、15ml離心管、觀察用倒置顯微鏡熒光顯微鏡和CCD
3、實驗步驟
細胞傳代
(1)試驗準備：200ul/1mlTip頭各一盒(以上物品均需高壓滅菌)，酒精棉球，廢液缸，試管架，微量移液器，記號筆，培養(yǎng)皿，離心管。
(2)棄掉培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用1ml的PBS溶液洗滌兩次。
(3)用Tip頭加入1mlTrypsin液，消化1分鐘(37。C，5%CO2)。用手輕拍培養(yǎng)瓶壁，觀察到細胞完全從壁上脫落下來為止。
(4)加入1ml的含血清培養(yǎng)基終止反應。
(5)用Tip頭多次吹吸，使細胞完全分散開。
(6)將培養(yǎng)液裝入離心管中，1000rpm離心5min。
(7)用培養(yǎng)液重懸細胞，細胞計數(shù)后選擇0.8X106個細胞加入一個35mm培養(yǎng)皿。
(8)將合適體積完全培養(yǎng)液加入離心管中，混勻細胞后輕輕加入培養(yǎng)皿中，使其均勻分布。
(9)將培養(yǎng)皿轉入CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，第二天轉染。
