一、 組織標本的準備
組織標本經甲醛固定24-48h，常規脫水、透明、浸蠟和包埋；4μm石蠟切片，貼在涂有APES膠的干凈載玻片上。58℃烤8-24h。ISH試劑的配制（所有試劑和用具均用DEPC水處理）。
二、操作流程：
一、雜交片的前處理
1、常規脫蠟至水。
2、0.01mol/L,pH8.0 EDTA(用0.02 mol/L,pH8.0TB配制) 98℃ 煮 15min;
3、自然冷卻 15min,蒸餾水洗2-5min;
4、2μg/ml蛋白酶K(用TE配制) 室溫 4min, 0.1mol/L甘氨酸PBS洗10min.；
5、蒸餾水洗2-5min;
6、75%,85%,95%,100%酒精系列脫水各1min；
二、雜交
將熒光標記探針加入48ul無RNAas PBS溶解，用雜交液（4×SSC,25%去離子甲酰胺, 無RNAas PBS）1:200稀釋,20ul雜交液并覆蓋，55℃雜交90min, 37℃雜交：24h，
三、雜交后洗滌（洗滌過程應避光）
(1)將切片浸入雜交后洗滌緩沖液的洗缸中72℃ 30min（洗缸應提前30min放入72℃水浴鍋內預熱到72℃，2×10min。
★雜交后洗滌緩沖液：2×SSC/0.3% NP-40
20×SSC pH5.3 100ml
蒸餾水 847ml
NP40 3ml
最后體積 1000ml
用1N NaOH調pH7.0-7.5。
(2)2×SSC.0.3% NP-4073℃洗3min。
⑶0.4×SSC.0.3% NP-4073℃洗3min
⑷70%乙醇洗 1min
(3)每片滴加10μl DAP1(4,6 diamidino-2-phenylinodole)封片襯染5min。
(4)不及時觀察，可將切片保存在-20℃冰箱暗處，觀察時復溫至室溫即可。
